4.دانشیار و عضو هیي ت علمی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز

Transcript

1 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٢ صفحه ٦٨٥٩ زمستان ١٣٩٢ بهینه سازي و بررسی ویژگی هاي فیزیکی لیپوزوم هاي حاوي نایسین 5 سمیرا تیزچنگ 1 محمود صوتی خیابانی 2* رضا رضایی مکرم 3 بابک قنبرزاده 4 یوسف جوادزاده 1. دانش آموخته گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز 2. استادیار و عضو هیي ت علمی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز 3. استادیار و عضو هیي ت علمی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز 4.دانشیار و عضو هیي ت علمی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی گروه مهندسی علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزي دانشگاه تبریز 5. دانشیار و عضو هیي ت علمی گروه فارماسیتوتیکس گروه فارماسیتوتیکس دانشکده داروسازي دانشگاه علوم پزشکی تبریز (تاریخ دریافت: 92/8/10 تاریخ پذیرش: 92/10/29) چکیده نایسین بهعنوان ماده ضدمیکروبی در صنایع غذایی و دارویی کاربردهاي متعددي دارد. در فرم آزاد بهدلیل واکنش با قند احیاکننده و بهطور غیراختصاصی با باندشدن بر لیپیدها و پروتي ینها خاصیت ضدمیکروبی آن کاهش مییابد. براي غلبه بر این محدودیت درونپوشانی نایسین با استفاده از لیپوزوم گزارش شدهاست. لیپوزومها بهدلیل امکان درونپوشانی مواد محلول در آب محلول در چربی و همچنین زیست تخریبپذیري قابلیت استفاده گسترده در صنایع غذایی را دارند. هدف این کار تحقیقی بهینهسازي و بررسی ویژگیهاي فیزیکی لیپوزومهاي حاوي نایسین است. در این تحقیق از روش سطح پاسخ براي بهینهسازي تولید لیپوزومها به روش گرمایی استفاده شد. طرح مرکب مرکزي شامل 18 آزمایش با در نظر گرفتن سه متغیر غلظت فسفولیپید (0/14 تا 2/14 گرم) سرعت فرایند (500 تا 1360 دور در دقیقه) و زمان فرایند (30 تا 90 دقیقه) و بررسی اثرات این متغیرها روي اندازه ذرات لیپوزومها ارزیابی شد. سپس کارایی درونپوشانی آزمونهاي گرماسنجی اسکنی افتراقی و میکروسکوپالکترونی گذاره براي نمونه بهینه شده انجام گرفت. مقادیر بهینه متغیرهاي غلظت فسفولیپید سرعت فرایند و دماي فرایند در بهینهسازي بهترتیب 2/14 گرم 930 دور در دقیقه و 90 دقیقه بود. نتایج حاصل از گرماسنجی اسکنی افتراقی (DSC) تشکیل ساختارهاي جدید را نشان داد و کارایی درونپوشانی کپسولهاي لیپوزومی حاوي نایسین 30 محاسبه گردید. در این مطالعه لیپوزومهاي حاوي نایسین بهطور موفقیت آمیزي با روش گرمایی تولید شدند و نتایج حاصل از گرماسنجی اسکنی افتراقی (DSC) و میکروسکوپالکترونی گذاره (TEM) تا ییدي بر تشکیل ساختار لیپوزوم میباشد. واژ ه هاى کلیدي: کارایی درون پوشانی گرماسنجی اسکنی افتراقی (DSC) میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM) نانولیپوزوم روش حرارتی روش سطح پاسخ * مسي ول مکاتبات: m.sowti@tabrizu.ac.ir

2 60 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٢ زمستان ١٣٩٢ 1 مقدمه به منظور حفظ بقا در محیط طبیعی و رقابت بر سر منابع با سایر میکروارگانیسم ها باکتري ها ترکیب هاي ضدمیکروبی تولید می کنند که منجر به مهار یا کشته شدن سوش هاي رقیب می شود. این ترکیبات به طور مشخص شامل دو گروه باکتریوسین ها و آنتی بیوتیک ها هستند که اساس طبقه بندي آن ها بر پایه مکانیسم بیوسنتز است [1]. باکتریوسین ها پپتید هاي سنتزي یا پروتي ین هایی با فعالیت ضد میکروبی هستند که توسط گروه هاي مختلفی از باکتري ها و قارچ ها تولید می شوند [2]. باکتریوسین ها در مقابل حرارت ph پایین حلال هاي آلی ضعیف سرما و یخ نمک ها و آنزیم ها مقاوم بوده و در نتیجه قابلیت استفاده در سیستم هاي غذایی را دارند [3]. باکتریوسین ها به عنوان نگه دارنده زیستی سالم و طبیعی توسط آنزیم هاي پروتي از دستگاه گوارش و روده بدون هیچ گونه عوارض جانبی سریع هضم و تجزیه می گردند. بنابراین می توان از این ترکیبات به عنوان یک مانع اصلی جهت کنترل عوامل بیماري زایی ناشی از مواد غذایی نام برد. شناخته ترین باکتریوسینی که نه تنها از نظر اقتصادي بلکه از نظر علمی به طور گسترده مورد مطالعه قرار می گیرد نایسین است [2]. نایسین پلی پپتید ضدباکتریایی با 34 اسید آمینه داراي وزن مولکولی 3/5 کیلودالتون بوده که توسط باکتري لاکتوکوکوس لاکتیس تولید می شود [45]. در سال 1998 سازمان غذا و دارو آمریکا نایسین را به عنوان یک ماده ي ایمن 1 براي استفاده در صنایع غذایی معرفی کرد و پس از آن نیز توسط اتحادیه اروپا مورد تا یید قرار گرفت. اکنون بیش از 50 سال است که در بیش از 50 کشور در سراسر دنیا نایسین به عنوان نگه دارنده استفاده می شود [6]. استفاده از نایسین در فرم آزاد در محصولات لبنی به دلیل عدم پخش یکنواخت و مصرف بیش تر اقتصادي نبوده هم چنین بر تولید اسید و آروماي باکتري هاي آغازگر در محصولی مانند پنیر اثر بازدارندگی دارد. ترکیب این ماده در محصولات لبنی با سایر اجزاي مواد غذایی نظیر چربی و پروتي ین موجب کاهش فعالیت ضد میکروبی آن می شود. به منظور حل مشکلات مذکور درون پوشانی نایسین در گویچه هاي فسفولیپیدي (لیپوزوم) می تواند راهکار مناسب باشد. این تکنیک می تواند توزیع مناسب و پایداري باکتریوسین را در شبکه ماده غذایی تضمین کند [87]. لیپوزومها ذرات کروي تشکیلشده از لیپیدهاي قطبی بوده و به محض قرارگرفتن در محیط آبی بهصورت سازمان یافته به فرم غشاهاي دولایهاي تجمع مییابند [9]. لیپوزومها میتوانند بهدلیل سازگاري زیستتخریبپذیري و عدمحضور ترکیبات سمی کاربردهاي گوناگونی در صنعت داروسازي آرایشی و بهداشتی و صنایع غذایی داشته باشند [4]. از روشهاي تولید لیپوزوم میتوان به روشهاي مکانیکی نظیر: سونیکاسیون هموژنیزاسیون و ریزسیالسازي و از روشهاي غیرمکانیکی میتوان به تبخیر فاز معکوس تخلیه ترکیب میسلی لیپید دترجنت خشککردن انجمادي و روش حرارتی یا روش مظفري اشاره کرد. در اغلب روشهاي مکانیکی براي تهیه لیپوزومها از حلال آلی فرار مثل کلروفرم و یا متانول استفاده میشود که البته مقادیر کمی از این مواد مضر در فاز لیپیدي و یا فاز آبی لیپوزوم باقی میماند و خروج آن بهطورعملی ممکن نیست. این مشکل امکان استفاده از این نوع حامل را براي اهداف کلینیکی محدود میکند. از این رو نسل دومی از لیپوزومهاي آنیونی ساختهشده که تولید آن بدون استفاده از مواد مضر و با بهکارگیري حرارت صورت میگیرد (روش حرارتی) [10]. تحقیقات زیادي در رابطه با روش حرارتی انجام شدهاست. کولاس و همکاران با استفاده از روش حرارتی و با در نظر گرفتن نسبتهایی متفاوت فسفولیپید لیپوزومهایی با توزیع ذرات باریکتر راندمان درونپوشانی بالا و پایداري بالا طی زمان و هدفگیري بهتر سلول باکتري تولید کردند [11] همچنین لاریدي و همکاران در تحقیقی میزان درونپوشانی لیپوزومهاي حاوي نایسین z را بررسی کردند و فاکتورهاي موثر بر میزان احتباس ph) غلظت محلول نایسین z و غلظت کلسترول در غشاهاي لیپیدي) را ارزیابی کردند. این تحقیق نشان داد ph محلول آبی حاوي نایسین z تا ثیر قابل توجهی بر روي میزان نایسین درونپوشانیشده داشت. بالاترین میزان احتباس در ph بین 2 تا 3 بود همچنین نتایج حاصل از افزایش غلظت نایسین ) تا 5 میلیگرم بر میلیلیتر) نشان داد افزایش غلظت باعث افزایش میزان درونپوشانیشده و طبق این نتایج نایسین تا حداکثر غلظت 5 میلیگرم روي غشاي لیپیدي قابل تثبیتشدن بود. همچنین در این تحقیق به نقش کلسترول 1. GRAS (Generally Recognized as Safe)

3 61 سميرا تيزچنگ و همکاران بهينه سازي و بررسي ويژگي هاي فيزيکي ليپوزوم هاي حاوي نايسين و دماي 4 درجه ي سانتی گراد جهت نگه داري طی زمان نیز پرداخته شد نتایج نشان داد افزایش محتواي کلسترول در غشاي لیپیدي تا 20 (وزنی وزنی) منجر به کاهش کارایی درون پوشانی شده و در نتایج پایداري لیپوزوم هاي حاوي نایسن z در دماي 4 درجه ي سانتی گراد و به مدت 27 روز در محیط هاي مختلف شامل شیر با سطوح چربی متفاوت (1 2 و ) 3/25 شیرپس چرخ آب پنیر شیرین و نمک فسفات بافر نشان داد لیپوزوم ها از نظر اندازه ذرات پایدار بودند [12]. در تحقیقی راستی و همکاران با استفاده از روش مظفري و روش هیدراسیون لایه نازك نانولیپوزوم هاي با استفاده 2 از اسیدهاي چرب دوکوزاهگزانوییک 1 و ایکوزاپنتانوي یک تولید کردند نتایج حاصل از میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان داد در روش مظفري نانوذرات ساختار کروي داشتند در حالی که در روش لایه نازك به دلیل اعمال فشار و نیروي برشی زیاد نانوذرات ساختار کروي نداشتند. اندازه ذرات در نانولیپوزوم هاي تولید شده به روش لایه نازك و روش حرارتی به ترتیب 200 و 362 نانومتر بود و نمونه هاي حاصل از این دو روش طی زمان دو ماهه اختلاف معنی داري از نظر اندازه ذرات نداشتند و نتایج حاصل از پتانسیل زتا در فرمولاسیون هاي لیپوزومی به روش هیدراسیون لایه نازك و روش مظفري به ترتیب 34/18 و 48/33 بود[ 13 ]. در تحقیقی دیگر وفابخش و همکاران با استفاده از روش مظفري نانولیپوزوم هاي حاوي آنزیم فلیورزیم 3 را تولید کردند در این تحقیق کارایی درون پوشانی 21/9 به دست آمد و نتایج نشان داد که درون پوشانی آنزیم در حامل لیپوزومی به نسبت آنزیم آزاد مشکلات ناشی از افزودن مستقیم آنزیم به شیر یا لخته ) مانند پروتي ولیز زودرس که منجر به استحکام نا مطلوب لخته تولید کم از دست رفتن مقدار زیادي از آنزیم افزایش قیمت محصول به علت نیاز به غلظت اولیه آنزیم و توزیع ضعیف آنزیم می شود) را در طول تولید پنیر کاهش می دهد[ 14 ]. با توجه به معایب روش هاي پیشین در تهیه لیپوزوم و هم چنین به دلیل این که تاکنون مطالعاتی در مورد بهینه سازي تولید لیپوزوم به روش گرمایی با روش سطح پاسخ انجام نشده است از این رو در این تحقیق بهینه سازي و بررسی ویژگیهاي فیزیکی لیپوزومهاي حاوي نایسین بررسی میشود. 2 مواد و روشها در این پژوهش فسفولیپید گرانولی با نام تجاري ال آلفا لسیتین با درجه خلوص 99 از شرکت Across آمریکا کلسترول پودري با خلوص 95 از شرکتAldrich آمریکا نایسین پودري با نام تجاري Valisin از شرکتMayasan ترکیه و گلیسرول با درجه خلوص 80 به همراه مواد شیمیایی جهت تهیه بافر از شرکت Merck آلمان تهیه شدند. 12 تهیه لیپوزوم ابتدا فسفولیپید با 50 میلیلیتر از بافر فسفات (ph56) و کلسترول با 50 میلیلیتر از بافر فسفات (ph56) جدا از هم به مدت یک ساعت تحت دماي محیط هیدراته شدند. کلسترول هیدراتهشده در حمام روغنی در دماي 110 درجهي سیلسیوس و زیر همزن (1370 دور در دقیقه) بهطور کامل ذوب شد[ 15 ]. سپس فسفولیپید و کلسترول ذوبشده به همراه نایسین (5 میلیگرم در 10 میلیلیتر) در بن ماري (W350B) در دماي 60 درجه سانتیگراد با هم مخلوط و تحت نیروي برشی دستگاه همزن مغناطیسی Jenwey1000) ساخت انگلستان) (مقادیر دور همزن: و 1360 دور در دقیقه میباشد) قرار گرفت. بهمنظور پایداري فرمولاسیون لیپوزومی به مدت 15 دقیقه در دماي اتاق قرار گرفت و سپس در یخچال در دماي 4 درجهي سانتیگراد نگهداري شد[ 4 و 16]. 22 تعیین اندازه ذرات بهمنظور مطالعه اندازه ذرات نمونهها از دستگاه سنجش اندازه ذرات Japan) (Shimadzu, Sald,1100 استفاده شد. اندازه نمونههاي تهیه شده بعد از یک ساعت نگهداري در دماي 4 درجه سانتیگراد و متوسط اندازه ذرات بر اساس قطر حجمی توسط این دستگاه تعیین شد (معادله 1 ). تمامی نمونهها در سه تکرار اندازهگیري شدند [17]. (1) 1. DHA (Docosa Hexaenoic Acid) 2. EPA (Eicosa Pentaenoic Acid) 3. Flavourzyme

4 62 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٢ زمستان ١٣٩٢ : قطر ذرات [ 3 و 4 [ D : میانگین قطر حجمی (میانگین حجم معادل) یا.DeBroukere mean 32 بهینه سازي لیپوزوم ها حاوي نایسین در این تحقیق از طرح مرکب مرکزي (RSMCC0318) با 18 آزمایش که شامل 4 آزمایش در نقطه مرکزي است به منظور بررسی آثار اصلی و متقابل فاکتورهاي غلظت فسفولیپید زمان فرایند و سرعت هم زدن بر ویژگی اندازه ذرات استفاده گردید. اثرات تغییر پذیري غیرقابل توجیه در پاسخ مشاهده شده به علت عامل هاي خارجی به وسیله تصادفی کردن ترتیب آزمایش ها کاهش داده شد. متغیرهاي مستقل طرح در پنج سطح 1/682) (+1/682 شامل غلظت X) 1 در سطوح (0/14 تا 2/14 گرم) فسفولیپید %w/w), X) 2 در سطوح (30 تا 90 دقیقه) سرعت زمان فرایند,min) X) 3 در سطوح (500 تا 1360 دور در دقیقه) بود هم زن,rpm) (جدول 1 ) در حالی که متغیر وابسته اندازه ذرات بود. براي تجزیه و تحلیل داده ها از نرم افزار SAS9.1 استفاده شد. معادله چند جمله اي درجه دوم استفاده شده در تجزیه و تحلیل به صورت زیر است: (2) β ij β ii و β i که در این فرمول Y متغیر وابسته یا پاسخ مدل β 0 بهترتیب ضرایب رگرسیون براي عاملهاي ضریب ثابت (عرض از مبدأ) ضریب اثر خطی ضریب اثر درجه دوم و ضریب اثر X j متغیرهاي مستقل می باشند. X i و متقابل هستند و 42 کارایی درون پوشانی براي تعیین کارایی درون پوشانی فرمولاسیون بهینه شده حاصل از مرحله ي قبل ابتدا 300 میکرولیتر از فرمولاسیون لیپوزوم به همراه 1200 میکرولیتر بافر داخل اپندورف تیوپ ریخته شد و بیست دقیقه توسط سانتریفیوژ با دور بالا (متر بر مجذور ثانیه) سانتریفیوژ گردید سپس روشناور (سوپر ناتانت) را به آرامی جدا کرده [8] و میزان پروتیي ن در فاز رسوب توسط کیت اندازه گیري پروتي ین پروگالول رد 1 محاسبه شد. اساس آزمایش به این صورت است که پروتي ین ها در حضور پروگالول رد و مولبدات 2 تشکیل کمپلکس قرمز رنگ می دهند و رنگ ایجاد شده توسط دستگاه اتو آنالیزور قابل اندازه گیري است.[18] سپس کارایی درون پوشانی طبق فرمول زیر محاسبه شد: (3) 52 گرماسنجی اسکنی افتراقی (DSC) به منظور اندازه گیري گرماسنجی بعد از منجمدکردن نمونه ي لیپوزوم (فرمولاسیون بهینه) در فریزر 80 درجه سانتی گراد نمونه هاي منجمدشده در دستگاه لیوفیلیزاتور christ) مدل ALPHA 1 4 ساخت کشور آلمان) به مدت 24 ساعت به طور کامل خشک شدند سپس اندازه گیري گرماسنجی در دستگاه DSC مدل Sald 2101Shimadzu ساخت ژاپن انجام 1. pyrogallol red 2. molybdate نوع متغیر واحد نمادریاضی سطوح کدبندي شده متغیر 1/ / X 1 mµ لظت فسفولیپید X 2 min زمان فرآیند X 3 rpm سرعت به همزدن جدول( 1 ) نمایش متغیرهاي مستقل فرایند و مقادیر آن ها

5 63 سميرا تيزچنگ و همکاران بهينه سازي و بررسي ويژگي هاي فيزيکي ليپوزوم هاي حاوي نايسين شد. کالیبراسیون دستگاه توسط ایندیوم صورت گرفت. ظرف آلومینیومی خالی بهعنوان مرجع استفاده شد و نمونههاي بهینه پرولیپوزوم (لیپوزومهاي خشک شده) و نمونههاي پودري (فسفولیپید کلسترول و نایسین) با وزن تقریبی 4 میلیگرم با سرعت 20 C/min در گستره دمایی 25 تا 300 درجه سانتیگراد اسکن شدند. از روي گرمانگاشت حاصل نقطه ذوب ترکیبات تعیین شد [19]. 62 آزمون میکروسکوپالکترونی گذاره (TEM) بهمنظور بررسی مورفولوژي ذرات و تا یید اندازه ذرات یک قطره از نمونه سوسپانسیونی ذرات لیپیدي بر روي گرید فیلم کربنی قرار دادهشده و پس از خشکشدن آن در دماي آزمایشگاه با استفاده از دستگاه میکروسکوپالکترونی گذاره 906) TEM)(Leo مدلKV Zeiss 100 ساخت آلمان) تصویربرداري شد. 3 نتیجهها و بحث 13 نتایج بهینهسازي لیپوزومهاي حاوي نایسین نتایج آزمایشهاي مرحله بهینهسازي تا ثیر غلظت فسفولیپید زمان فرایند و سرعت همزدن روي میزان اندازه ذرات در جدول (2) آورده شدهاست. با توجه به جدول بیشترین و کمترین میزان اندازه ذرات به میزان 5220 و 410 نانومتر (در نمونههاي شماره یک با مشخصات غلظت 7/6644(gr) سرعت همزدن 674(rpm) زمان فرایند 42(min) و در نمونه یازده با مشخصات غلظت 2(gr) سرعت همزدن 930(rpm) زمان فرایند 60(min) مشاهده شد. نتایج آنالیز واریانس متغیرهاي مورداستفاده روي اندازه ذرات در جدول( 3 ) قابل مشاهده است. با توجه به این جدول تا ثیر خطی غلظت فسفولیپید و سرعت به همزدن و اثر درجه دوم غلظت فسفولیپیدروي سایز ذرات معنیدار بود و مقادیر P براي مدل (0/01>p) و براي عدم برازش (عدم تطابق دادهها با مدل) (0/27) تا ییدي بر تطابق خوب مدل با داده هاي آزمایشی دارد. مقدار عددي ضریب تبیین R 2 adj براي مدل رگرسیونی بهدست آمده 78 بود. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که مدل رگرسیونی توانسته رابطه بین متغیرهاي مستقل (زمان همزدن و سرعت همزن) و متغیر وابسته (اندازه ذرات) را نشان داده و پیشبینی کند. مدل بهدست آمده براي (X 2 (X 1 غلظت فسفولیپید ) پیشبینی تا ثیر سرعت همزدن ) X) 3 بر روي اندازه ذرات لیپوزوم (Y) با حذف زمان همزدن ) عوامل غیرمعنیدار بهصورت زیر بهدست آمد (4) Y = X X X 1 با استفاده از مدل RSM درجه دو براي کمترین اندازه ذرات لیپوزوم مقادیر بهینه غلظت فسفولیپید 14/2 (گرم) دور همزدن 930 (دور در دقیقه) و زمان فرایند 90 (دقیقه) تعیین شد. 23 کارایی درونپوشانی مقدار پروتي ین موجود در فرمولاسیون بهینه لیپوزوم بر اساس فرمول محاسبه شد و نتایج حاصل از میزان درونپوشانی لیپوزومهاي حاوي نایسین در حدود % 30 محاسبه گردید. در پژوهشی که بر روي درونپوشانی نایسین با استفاده از فسفاتیدیل کولین خالص صورت گرفت درصد درونپوشانی در فرمولهاي مختلف لیپوزومی در حدود 30% گزارش شد. همچنین Wilkinson و همکاران در تحقیقات خود به این نتیجه رسیدند که تا ثیر افزودن کلسترول شامل: افزایش پایداري کاهش نفوذپذیري و کاهش میزان درونپوشانی با فشردهتر کردن ساختار لیپوزوم میباشد. با توجه به اینکه در این تحقیق از کلسترول نیز استفاده شدهاست میتوان یکی از عوامل کم بودن نسبی میزان درونپوشانی را حضور کلسترول نام برد [21] همچنین عوامل دیگري که در کاهش راندمان درونپوشانی نقش دارند شامل: ماهیت ماده و خلوص مادهي درونپوشانی شده است [22]. Laridi و همکاران و همچنین Colas و همکاران در خصوص ماهیت مادهي درونپوشانیشده به این نکته اشاره کردند که بهدلیل آبگریزبودن نایسین نایسین در میان غشاي دو لایهاي قرار میگیرد و اگر انرژي جهت کاهش اندازه ذرات اعمال شود بهدلیل اعمال تنش میزان درونپوشانی کاهش

6 64 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٢ زمستان ١٣٩٢ نمونه * میانگین اندازه ذرات نمونه * میانگین اندازه ذرات 524±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/ ±0/004 9 * میانگین اندازه ذرات برحسب نانومتر می باشد. جدول( 2 ) نمایش متغیر وابسته (میانگین اندازه ذرات) P F منبع تغییرات ضرایب رگرسیون درجه آزادي (df) مجموع مربعات (SS) میانگین مربعات (MS) 0/0001 ** 46/ / / /315 X 1 0/1970 1/9761 1/0047 1/ /271 X2 0/0499 * 5/3217 2/7059 2/ /445 X 3 0/0140 ** 5/6620 4/2472 4/ /554 X12 0/0552 5/0248 2/5549 2/ /565 X1 X2 0/1572 0/7627 0/5579 2/4346 0/0975 0/3737 1/2379 0/ /1900 1/2379 0/0496 0/ /393 0/062 0/154 0/0001 ** 13/ / / مدل 0/0006 ** 17/9295 9/ / اثر خطی 0/0605 3/7325 1/8978 5/ اثردرجه دوم 0/1235 0/2730 2/6110 1/5286 1/3276 0/7501 0/9645 0/6310 3/ /5017 4/ / / X 1 X 3 X 22 X 2 X 3 اثر متقابل باقی مانده عدم تطابق داده ها با مدل خطاي خالص کل جدول( 3 ) نتایج تجزیه واریانس تاثیرغلظت فسفولیپید زمان هم زدن و سرعت هم زدن بر روي اندازه ذرات

7 65 سميرا تيزچنگ و همکاران بهينه سازي و بررسي ويژگي هاي فيزيکي ليپوزوم هاي حاوي نايسين مییابد. در خصوص خلوص ماده میتوان به این مورد اشاره کرد که خلوص ماده درونپوشانیشده و خلوص مواد مورد استفاده در فرمولاسیون بر بار سطحی خصوصیات تراوایی قابلیت انحصار و میزان درونپوشانی تا ثیر خواهد گذاشت [11 و 12]. 33 نتایج حاصل از بررسی گرماسنجی اسکنی افتراقی (DSC) آنالیز DSC بهمنظور بررسی رفتار کریستالی نایسین لسیتین کلسترول و حالت توزیع نایسین (کریستالی آمورف و پخششده بهصورت مولکولی) در ساختار لیپوزومها در فرمولاسیون بهینه مورد ارزیابی قرار گرفت و همچنین تداخل نایسین در حامل لیپوزومی و اثر آن بر ذرات و تغییراتی که در شبکه کریستالی آن بهوجود میآورد نیز بررسی گردید. شکل ( 1 الف) منحنی گرمایشی DSC مربوط به لسیتین پودري میباشد. همانطور که در شکل مشاهده میشود در نمونه لستین پودري دو پیک اندوترمیک مشاهده شد پیک اندوترمیک اول در دماي 198 درجه سانتیگراد و پیک اندوترمیک دوم در دماي 233 درجه سانتیگراد مشاهده شد. وجود دو پیک اندوترمیک نشان دهنده دو نوع بلور در لستین پودرياست.این دونوعبلورمیتواندبهعلت تشکیلدونوعبلور چربی با نظم و ساختار بلوري و پایداري ترمودینامیکی متفاوت از یک ماده واحد باشد و یا بهدلیل استفاده از لستین تجاري حاوي چندین نوع فسفولیپید باشد. با توجه به شکل (1 ب) (منحنی مربوط به کلسترول پودري) پیک اندوترمیک ذوب در دماي 150/85 درجه سانتیگراد شکل( 1 ) نتایج حاصل از بررسی گرماسنجی اسکنی افتراقی (DSC) (الف) لستین پودري (ب) کلسترول پودري (ج) لستین لیپوزومی (د) لستین لیپوزومی حاوي کلسترول (ه) لستین لیپوزومی حاوي نایسین (و) لستین لیپوزومی حاوي نایسین و کلسترول

8 66 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٢ زمستان ١٣٩٢ مشاهده شد. Rudra و همکاران در تحقیقات خود دماي ذوب کلسترول پودري را 149 درجه سانتیگراد گزارش کردند[ 23 ]. در مورد نمونه لستین لیپوزومی (شکل 1 ج) دو پیک اندوترمیک مشاهده شد پیک اندوترمیک اول در دماي 218 درجه سانتیگراد و پیک اندوترمیک دوم در دماي 150 درجه سانتیگراد مشاهده شد. کاهش نقطه ذوب در اثر تشکیل لیپوزوم میتواند ناشی از این باشد که در اثر تشکیل لیپوزومها اندازه ذرات نسبت به حالت توده کاهش مییابد و این کاهش اندازه ذرات موجب کاهش دماي ذوب میگردد. نتایج این تحقیق با نتایج Bunjes و Unruh مطابقت داشت. این دو محقق در تحقیقات خود به این نتیجه اشاره کردند که نقطه ذوب نانوذرات تولید شده نسبت به توده مواد (لسیتین خالص) کمتر میباشد[ 24 ]. شکل( 1 د) نشان میدهد که نمونه حاوي لستین و کلسترول داراي دو پیک اندوترمیک میباشد. پیک اندوترمیک اول در دماي 211 درجه سانتیگراد و پیک اندوترمیک دوم در دماي 189 درجه سانتیگراد مشاهده شد. این امر نشان دهنده این است که با ورود کلسترول به ساختار لیپوزومی دماي ذوب کاهش یافته است. احتمالا کلسترول بهعنوان ناخالصی موجب تشکیل بلورهاي ناقصی از لیپوزومشده و این امر موجب کاهش دماي ذوب شدهاست. Chung و همکاران تا ثیر افزودن کلسترول بر دماي انتقال فاز فسفاتیدیل کولین (10) C: C (18) (نوعی فسفاتیدیل کولین با ترکیبی از دو زنجیره آسیل نامتقارن) را بررسی کردند. نتایج نشان داد که با افزودن کلسترول آنتالپی کل و دماي انتقال فاز کاهش یافت و همچنین پهناي پیک انتقال افزایش یافته و در 25 درصد مولی کلسترول بهطور کامل حذف شد [25] همچنین Hung و همکاران در تحقیقات خود به این نتیجه رسیدند که گروه متیل انتهایی اسید چرب کلسترول موجب بینظمی در ماتریکس لیپید میشود که این امر منجر به کاهش دماي انتقال فار در دولایه بههم پیوسته ترکیبی از دو زنجیره آسیل میشود [26]. Darvis و همکاران در تحقیقات خود در رابطه با فاکتورهاي موثر در ساختار دولایه لیپیدي به این نتیجه رسیدند فاکتورهایی از قبیل تفاوت در طول زنجیره آرایش مولکولی تعداد و موقعیت باندهاي دو گانه و تفاوت در وضعیت قرارگیري زنجیرهها نقش مهمی در تعیین ساختار دو لایه لیپیدي دارد. بسیاري از این فاکتورها با قرارگیري کلسترول در ساختار تغییر میکند. همچنین آنها معتقد بودند که حلقه تتراپیرولی کلسترول تا ثیر بینظمکنندگی بر روي زنجیرههاي آسیل دارد [27]. نمونه حاوي لستین و نایسین لیپوزومی داراي دو پیک اندوترمیک میباشد (شکل 1 ه). پیک اندوترمیک اول در دماي 220 درجه سانتیگراد و پیک اندوترمیک دوم در دماي 190 درجه سانتیگراد مشاهده شد که نشاندهنده یک افزایش جزیی در دماي ذوب میباشد. با توجه به اینکه پودر نایسین پیکهاي تیز و بزرگی را نشان ندادهاست بهنظر میرسد این امر میتواند مربوط به ساختاري تقریبا آمورف آن باشد ولی انتقال شیشهاي در دماي 186 و 216 درجه سانتیگراد قابل مشاهده است. نمونه حاوي لستین کلسترول و نایسین )شکل 1 و) داراي دو پیک اندوترمیک میباشد. پیک اندوترمیک اول در دماي 214 درجه سانتیگراد و پیک اندوترمیک دوم در دماي 189 درجه سانتیگراد مشاهده شد. کاهش در دماي ذوب نسبت به لیپوزوم حاوي نایسین نشاندهندهتا ثیر کلسترول است که بهعنوان ناخالصی عمل کردهاست. 43 میکروسکوپالکترونی گذاره (TEM) بهمنظور بررسی مورفولوژي ذرات و تا یید اندازه ذرات تصویر میکروسکوپالکترونی از نمونه بهینهشده فاقد کلسترول تهیه شد (شکل 2). تصویر مربوطه وجود وزیکولهاي کروي شکل یونی لاملار 1 با اندازه 180 نانومتر را نشان میدهد که این نتایج نتایج حاصل از اندازهگیري ذرات با استفاده از دستگاه سنجش اندازه ذرات در فرمولاسیون بدون کلسترول را تا یید مینماید. 4 نتیجهگیري نتایج این پژوهش نشان داد سرعت و زمان همزدن تا ثیر قابل توجهی در سایز ذرات دارد. نتایج حاصل از گرماسنجی اسکنی افتراقی و میکروسکوپالکترونی گذاره تا ییدي بر تشکیل لیپوزوم و نتایج درونپوشانی تا ییدي در جهت استفاده از روش حرارتی در تشکیل لیپوزومها میباشد. 1. ULVS (Unilamellar Vesicles)

9 67 سميرا تيزچنگ و همکاران بهينه سازي و بررسي ويژگي هاي فيزيکي ليپوزوم هاي حاوي نايسين شکل( 2 ) تصویر به دست آمده از میکروسکوپ الکترونی گذاره of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products. Int. Dairy. J., 18, [6] Bedg, D., Bundale, S., Mashitha, P., Rudra, J., Nashikkar, N., Upadhyay, A. (2011). Immunomodulatory efficacy of nisin a bacterial lantibiotic peptide. Int. J. peptide. Sci., 17, [7] Phikunthong, K., Varissaporn, M., Warin, C. (2011). Potential use of niosomes for encapsulation of nisin and EDTA and their antibacterial activity enhancement. Food. Res. Int., 44, [8] زایرزاده ا. مرتضوي س.ع. جعفري م.ر. افشارنژاد س. طباطبایی یزدي ف. نصیري محلاتی م. (1390) بررسی اثر ضدباکتریایی نایسین به دو فرم آزاد و نانوانکپسوله در لیپوزوم بر ماندگاري و کاهش جمعیت لیستریایی پنیر سفید ایرانی فرآپالایش. نشریه پژوهشهاي علوم و صنایع غذایی ایران شماره 3 ص [9] Keller, B.C. (2001). Liposomes in nutrition. Trend. Food. Sci. Technol., 12, [10] Mozafari, M., Flanagan, J., Matiamerino, L., منابع [1] حمیدي م. موسوي نسب س.د. احمدي ن. بساطی غ. اولاد غ. سلیمیان ج. زرگر م. (1391) سنتز پپتیدهاي ضدمیکروبی در باکتريها. مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی ایلام. دوره بیستم شماره چهارم ص [2] Chollet, E., Sebti, I., MartialGros, A., Degraeve, P. (2008). Nisin preliminary study as a potential preservative for sliced ripened cheese: NaCl, fat and enzymes influence on nisin concentration and its antimicrobial activity. Food Cont., 19, [3] Cheikh, Y., Pogori, N., Chen, W., Zhang, H. (2008). Antimicrobial proteinaceous compounds obtained from bifidobacteria: From production to their application. Int. J. Food. Microb., 125, [4] Da SilvaMalheiros, P., JonerDaroit, D., Brandelli, A. (2010). Food applications of liposomeencapsulated antimicrobial peptides. Trend. Food. Sci. Technol., 21, [5] SobrinoLopez, A., MartınBelloso, O. (2008). Use

10 68 فصلنامه علوم و فناوری های نوين غذايی سال اول شماره ٢ زمستان ١٣٩٢ Clin. Chem., 32, [19] Pople, P.V., Singh, K.K. (2011) Development and evaluation of colloidal modified nanolipid carrier: Application to topical delivery of tacrolimus. Eur. J. Pharm. Biopharm., 79, [20] Benech, R., Kheadr, E. (2002). Inhibition of Listeria innocua in cheddar cheese by addition of nisin Z in liposomes or by in situ production in mixed culture. Appl. Envi. Micro., 68, [21] Wilkinson, M., Kilcawley, K. (2005). Mechanisms of incorporation and release of enzymes into cheese during ripening. Int. Dairy. J., 15, [22] خسروي دارانی ك. مظفري م.ر. (1390). نانولیپوزومها کاربردهاي درمانی و صنعتی. انتشارات دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی و درمانی شهید بهشتی. [23] Rudra, A., Deepa, R.M., Ghosh, M.K., Ghosh, S., Mukherijee, B. (2010). Doxorubicinloaded phosphatidylethanolamin econjugated nanoliposomes: in vitro characterization and their accumulation in liver, kidney, and lungs in rats. Int. J. Nano., 5, [24] Bunjes, H., Unruh, T. (2007). Characterization of lipid nanoparticles by differential scanning calorimetry, Xray and neutron scattering. Adv. Drug. Deliv. Rev., 59, [25] Chung, P.L.G., Choate D. (1989). Calorimetric studies of the effects of cholesterol on the phase transition of C (18): C (10) phosphatidylcholine. Biophys. J., 55, [26] Hung, C., Levin, I.W. (1983). Effect of lipid chain length inequivalence on the packing characteristics of bilayer assemblies. J. Phys. Chem., 87, [27] Davis, P.J., Keough, K.M.W. (1985). Chain arrangements in the gel state and the transition temperature of phosphatidylcholine. Biophy. J., 48, Awati, A. (2006). Recent trend in lipidbased nanoencapsulation of antioxidants and their role in food, J. Sci. food. Agri., 86, [11] Colas, J.C., Wanlong, S., Malleswara, V.S.N., Omri, A., Mozafari, M.R. (2007). Microscopical investigations of nisinloaded nanoliposomes prepared by Mozafari method and their bacterial targeting. Micron., 38, [12] Laridi, R., Kheadr, E.E., Benech, R.O., Vuillemard, J.C., Lacroix, C., Fliss, L. (2003). Liposome encapsulated nisin Z: Optimization, stability and release during milk fermentation. Int. Dairy. J., 13, [13] Rasti, B., Jinap, S., Mozafari, M., Yazid, A.M. (2012). Comparative study of the oxidative and physical stability of liposomal and nanoliposomal polyunsaturated fatty acids prepared with conventional and Mozafari methods. Food. Chm., 135, [14] Vafabakhsh, Z., KhosraviDarani, K., Khajeh, Kh., Jahadi, M., Komeili, R., Mortazavian, A.M.(2013). Stability and catalytic kinetics of protease loaded liposomes. Biochem. Eng. J., 72, [15] Mozafari, M., Johnson, C., Demetzos, C. (2008). Nanoliposomes and their application in food nanotechnology. Int. J. Liposome. Res., 18, [16] Mozafari, M., Mortazavi, S. (2005). Liposomes: an overview of manufacturing techniques. Int. J. Liposome. Res., 18, [17] Marsanasco, M., Márquez, A.L., Wagner, J.R., Alonso, S., Chiaramoni, N.S. (2011). Liposomes as vehicles for vitamins E and C: An alternative to fortify orange juice and offer vitamin C protection after heat treatment. Food. Res. Int., 44, [18] Watanabe, N., Kamei, S., Ohkubo, A., Yamanaka, M., Ohsawa, S., Makino, S. (1986) Urinary protein as measured with a pyrogallol redmolybdate complex. Manually and in a Hitachi 726 automated analyzer.